יסודות - הר.8 - שיטות מחקר

יסודות ביולוגיים28/11

הרצאה 8 – שיטות מחקר

--> שבוע הבא אין שיעור, יש תרגיל

--> בשבוע אחרי יש שיעור, אין תרגיל

--> לקרוא את הספר, החומר שלנו לא מספיק

איך המדענים יודעים את מה שהם יודעים?

שק' 2:

יושבים מדענים באוניברסיטאות, בד"כ, ושואלים שאלות על העולם.

בהמשך, עולות היפותיזות ספציפיות.

אח"כ עורכים תצפיות בטבע או עורכים ניסויים מדעיים כדי לבחון את ההיפותיזות.

ניסויים: עורכים אותם, מנתחים תוצאות ובודקים האם התוצאות מאששות את ההיפותיזות.

בד"כ התוצאות מניסוי אחד חלקיות ואינן מספקות, ולכן עושים ניסויים נוספים, וכך בונים תזה.

אח"כ כותבים מאמר על כך ושולחים לכתבי עת מדעיים. אם כתב העת מוכר, התוצאות הופכות לחלק מגוף הידע שאנו קוראים לו מדע.

שק' 3:

אי אפשר לחקור אוכלוסייה שלמה, ולכן בודקים מדגם.

בדרך זו מפיקים ידע בשיטות שונות, וכל חתיכות הידע שמצטברות בונות תמונה שהיא הידע באותו הרגע.

במשך הזמן מתפתחות שיטות מחקר יותר מתקדמות, התמונה נעשית יותר ויותר רחבה, והידע הקודם הופך פחות רלוונטי.

למרות זאת, הידע החדש מקדם אותנו, ויש לו השלכות מעשיות, בכל שלב – אפילו שזה לא מושלם ומוחלט.

השימוש בחיות ניסוי במחקר פסיכוביולוגי – מבחינה אתית:

שק' 4 :

רב הניסויים במדעי החיים, הרפואה והמח באופן ספציפי, נעשה בחיות ניסוי.

נפתח בנושא זה, כי הוא מאד טעון.

הצדקה – אנחנו רוצים להבין את התהליכים המוחיים כדי לעזור לבני אדם. אי אפשר לבחון מנגנונים ומבנים בצורה ישירה בבני אדם, ולכן משתמשים בחיות ניסוי. הבנת הבעיות תאפשר ייצור פתרונות – פרמקולוגיים, כירוגיים וכו'.

לחלק גדול מהמדענים תספיק ההצדקה שהרחבת הידע, בין היתר בעזרת ניסויים בבע"ח, היא חלק אינהרנטי מהאנושיות, וזו סיבה מספקת. (לא כל ניסוי יוביל באופן ישיר לריפוי בני אדם! ).

זה לא אומר שהכול לגיטימי – יש עקרונות אתיים שלפיהם עובדים:

• לגרום כמה שפחות סבל וכאב לבע"ח במהלך הניסוי.

• להקטין כמה שאפשר את המדגמים (באופן שעדיין אפשר להגיע לתוצאות תקפות).
• ניסיון לעבור מחיות גבוהות (כמו קופים) לחיות פשוטות יותר (רב המחקר הביולוגי נערך במכרסמים – עכברים וחולדות, בעיקר בגלל אנרציה, שבעקבותיה יש לנו ידע רב ויכולת טובה לבצע בהם מניפולציות).

• במידת האפשר משתמשים בתאים ובמודלים ממוחשבים (אי אפשר ממש להסיק ממודל ממוחשב לגבי אדם).
• וועדות אתיות אליהן מגישים בקשות ניסוי.

שק' 5 – דוגמאות למחקרים שנעשו בחיות ניסוי ותורגמו לרווחת האנושות:

• פיצוח הקוד הכימי של המוח
• מחלת הפוליו
• פריונים
• התפתחות המוח והראיה
• הבסיס הביולוגי של למידה וזיכרון
• מחלת פרקינסון, טרשת נפוצה, שבץ מוחי...

שק' 6 – פיצוח הקוד הכימי של המוח:

בהתחלה היה צריך לפתח שיטות לסימון המסלולים העצביים במח , ושיטות שיאפשרו לחזות בתהליכים במוח.

בהמשך השמשמו בידע שנוצר כדי לפתח תרופות פסיכיאטריות.

שק' 7 – מחלת הפוליו:

מחלה שגורמת לשיתוק, נגדמת על ידי וירוס שהורס נוירונים מטווריים ופוגעת בעיקר בילדים.

בודדו את הווירוס מתוך חיות, גילו על אילו נוירונים הוא משפיע, ובהמשך פיתחו נגדו חיסון שכולנו מקבלים.

שק' 8 – כמה מחלות דומות במוח:

מחלת סקרפי היא מחלה שגורמת להרס של נוירונים בכבשים.

קניבלים שאכלו את המוחות של האויבים שלהם קיבלו מחלה בשם קורו.

(עוד כמה מחלות, במצגת...)

הזריקו תאים חולים לחיות ניסוי והתחילו לאפיין את גורמי המחלה. זה היה מאד קשה, כי זה היה חלבון בעל צורה מרחבים לא נורמלית(ולא חיידק או ווירוס), בשם פריון, ופיתחו תרופות וטיפולים נגדם.

שק' 9:

ניסויים בהם גידלו חיות בכל מיני תנאים (למשל: חושך) איפשרו להבין את התפתחות מערכת הראיה, דבר שהוביל לפרוצדורות שאיפשרו לתקן את הראיה (למשל: הבנת הקריטיות של טיפול מוקדם בבעיות ראיה).

(תאור הניסויים המועילים כאן מאד מקוצר, יש פירוט במצגת).

שק' 10 – הבסיס המוחי ללמידה זיכרון:

כדי ללמוד על תפקוד המח לעיתים רחוקות יש מקרים אנושיים (כמו HM) שאפשר לחקור, בד"כ מוציאים חלקים מסוימים של המח מחיות ניסוי ובודקים.

שק' 11:

למחלות רבות יש מודלים בחיות ניסוי ורב הטיפולים והתרופות שקיימים או מפתחים הם דרך מחקר בחיות ניסוי.

שק' 12 – הקשר בין המוח ומערכת החיסון:

בראשית היה ידוע שיש קשר בין לחץ למערכת החיסון.

רז ירמיהו חוקר את המנגנונים הספציפיים מנסה להראות שיש קשר דו כיווני – מערכת החיסון משפיעה גם היא על המוח, דרך חומרים שונים שמ. החיסון משחררת לדם, קצוות עצבים קרניאליים שמגיעם מהגוף אל המח ומוסרים אינפורמציה, דבר שגורם להפעלת תהליכים בגוף – כמו העלאת חום, סימפטומים התנהגותיים – חוסר תיאבון, עייפות, מצב רוח לא טוב. התנהגות המחלה וגם התהליכיים הגופניים הם תוצאה של המח, ולא תוצאה ישירה של החיידק או הווירוס.

תוך כדי מחקר הוא ראה מחקר של פסיכיאטר בלגי, בו נאמר שבדיכאון יש הפעלה של מערכת החיסון, ואז הוא הבין שהסימפטומים של "התנהגות מחלה", עוצמתיים ולאורך זמן, הם בדיוק המאפיינים של דיכאון.

הוא חשב שאפשר להסתכל על מאפיינים של דיכאון בחיות (חוסר תיאבון, הפסקת אינטראקציות חברתיות, בעיות קשב, ריכוז, זיכרון, בעיות שינה....). הוא רצה לבדוק אם הפעלה של מערכת החיסון יכולה לגרום למצב דיכאון בחיות, וגילו שאכן כך.

לא רק זה, אלא שאם מטפלים בחיות בחומרים אנטי – דפרסניטיים (כמו פרוזק) אז אפשר למנוע את השפעות הפעלת מערכת החיסון על המאפיינים של דיכאון.

למשל: חולדות שניתנת להן בחירה בין תמיסה מתוקה ומים, יבחרו כמעט תמיד במתוק.

אם מערכת החיסון מופעלת – יבחרו חצי חצי.

אם לפני המחלה הן מקבלות במשך שלושה שבועות (אנטי דפרסנטים לא עובדים מייד!) חומא אנטי – דיכאוני, הן יחלו, אבל לא יפתחו התנהגות מחלה – יבחרו במתוק.

כך גם בתיאבון ומשחקיות.

החיות חולות, ומתנהגות כאילו הן לא חולות.

שק' 20:

בכנס הוא פגש פסיכיאטר שמטפל בחולים המחלקה אונקולוגית. הוא סיפר שמטפלים אצלו בחולי סרטן על ידי הפעלת מערכת החיסון. הבעיה היא, האנשים שמטופלים בדרך זו נכנסים לדיכאון. אחרי 12 שבועות של טיפול חצי מהאנשים הם בmagor depression – מפתחים את כל הסימפטומים של דיכאון, עד כדי התאבדות.

הם טיפלו בכך שזמן מסוים לפני הטיפול התחילו לטפל בחולים בחומרים אנטי דפרסנטיים (טיפול מונע) לפני הטיפול שמפעיל את מערכת החיסון –> וזה יישום של המחקר, לתועלת בני אדם.

עד כאן הצדקות אתיות.

שיטות מחקר:

שק' 22:

מחקר באנשים שיש אצלם הרס (לא מכוון לניסוי...) של אזורים מסוימים במח.

זה קורה אצל אנשים מסיבות שונות:

• פיניאס גייג', למשל.
• שטף דם מוחי

הבעיה: בד"כ הנזק כללי, ולא תחום לאזור מסוים, ולכן קשה להסיק סיבתיות, אלא אפשר לקבל תובנות כלליות, אך לא ידע על תפקודים של אזורים מסיוימים.

שק' 24:

כדי לעשות את זה הולכים לחיות, הורסים חלק מהמוח באופן ממוקד ומדויק (אזור מסוין או חלק מהאזור), ובודקים מה קורה. זאת שיטה מאד מקובלת במחקר.

שק' 25:

לעריכה של נזק יזום באזור במח קוראים (כתלות בגודל האזור) lesion / ablation.

• צריך להיזהר בהסקת המסקנות – למשל: עשינו נזק באזור הראייתי, ורואים שהחיה לא רצה כאשר שמים לה מזון בצד מסוים של הכלוב. לפני שמסיקים, צריך לבדוק משתנים כללים, למשל: שלא השפענו על יכולות מוטוריות, או על מוטיבציה.
• חשוב לדעת שכל תפקוד מבוסס על אינטראקציות בין מספר אזורים במח (למשל: קריאה- זיהוי אותיות, פירוש תווים לגירויים שפתיים, הבנת שפה ועוד הרבה. הרס של כל אחד מהאזורים יהרוס את יכולת הקריאה).
• בכל אזור במח יש גופי תאים, אך גם אקסונים שעוברים דרך האזור. הרס באזור יפגע לא רק בגופי התאים, אלא גם באקסונים שעוברים שם.
• צריך להיזהר גם מייחוס שלילי- גם אם לא רואים נזקף למוח יש יכולת להתארגן מחדש ולפצות על הנזק. ייתכן שנראה שהתפקוד לא נפגע, אך זה בגלל מנגונוני פיצוי, למרות שהאזור כן אחראי לתפקוד הספציפי.

שק' 26 – איך יוצרים את הנזק (לזיות – באזור יותר קטן)?

• שאיבה (אם האזור קרוב לפני הגולגולת)
• החדרת אלקטרודה והעברת זרם חשמלי
• החדרת צינורית ורדכה חומצה קאנית – גורם להרס של גופ התאים אך לא של האקסונים (קשור לגלוטומט והרס עצמי של התאים, לא הבנתי איך בדיוק).
• הידרוקסידופמין 6 - רק התאים הדופמינרגיים יעשו לחומר reuptake ולכן רק הם יהרסו.
• אפשר להחדיר חומר של הרדמה מקומית וכך ליצור נזק הפיך.

בכל ניסוי כזה, הדרך בה עושים את המחקר היא לעשות נזק, ולהשוות לביקורת. צריך ביקורת לכל הפרוצדורה של הניסוי. בקבוצת הביקורת עושים הכול – את כל הפרוצדורה הניתוחית חוץ מהחדרת החומר עצמו (sham = כאילו).

שק' 27:

הרעיון הוא לעשות נזק על אזור קטן מאד שאחראי לתפקיד מסוים. ככל שהאזור יותר קטן המסקנה יותר ספציפית.

מוחות של מכרסמים הם מאד קטנים! איך אפשר להגיע לאזור ספציפי?

לשם כך משתמשים במכשיר ניתוח סאראוטקסי, שמאפשר למדוד את המיקום התלת מימדי של כל נקודה במח ביחס לנקודות ציון על פני הגולגולת.

אנחנו נעזרים קודם כל בסימני שנמצאים על פני הגולגולת (יש עליה מעין תפרים שהם הסגירה של העצם, לאחר השלב בהתפחות בו היא רכה) הם נותנים לנו נקודות ייחוס מהן אפשר למדוד ולהגיע לכל אזור של המח. נקודות הייחוס מאפשרות להשתמש במפה, ובעצם סדרה של מפות (אטלס) של המוח – אטלס סטריאוטקסי. המפות נותנות לנו את מפת המח בסדרה של חתכים דו מימדיים, על פני 3 חתכים.

• רוסטרלי – קאודלי
• מדיאלי לטרלי
• עומק

כך אפשר למצוא מיקום של כל נקודה, ולמדוד בעזרת המכשיר.

זה משמש לא רק בניסויים, אלא דם בניתוחים בבני אדם.

שק' 31:

ניתוח סטריאטוקסי מאפשר להכניס צינורית במח,(-קנולה) ודרכה להחדיר חומרים, או תרופות, או לגרום ללזיה – כימית או הפיכה.

אפשר להחדיר את הצינורית לאפשר לחיה להחלים (כשהצינורית מודבקת בפנים!) וביום הניסוי להזריק דרך הצינורית את החומר.

שק' 32:

מיקרודיאליזה – חיבור צינורית למח, ואז אפשר לתת לחיה להחלים, ולגרום לה לבצע את הניסוי (למשל: מבוך). מתחילים לשאוב מדגמים של הנוזל, ובוחנים את החומרים בתוכו. כך אפשר לבדוק מה קרה בסינפסות במהלך ההתנהגות (למשל: מה היה ריכוז הדופמין?)

שק' 33 – רישום הפעילות העצבית חשמלית:

אפשר להכניס את האלקטרודה לתא ממש – רישום תוך תאי,

אפשר לבדוק פעילות באוכלוסיה שלמה של תאים.

שק' 34 - EEG:

הרישום החשמלי לא יכול לתת לנו אינפומציה לגבי מיליונים של תאים.

כדי לקבל אינורמציה גלובלית על פעילות המח נשתמש באלקטרודות הרבה יותר גדולות, ואותם נשים על פני הגולגולת. משווים פעילות של אלקטרודות וכך אפשר לקבל אינפורמציה על פעילות גלובלית (למשל: מצב שינה, לעומת שנת חלום, לעומת מצב ערנות).

זוהי טכנולוגיה הולכת ומתפתחת, אפשר גם לרשום פעילות מאזורים יותר ממוקדים במח – למשל: קורטקס שמיעתי או קורטקס וויזואלי.

שק, 35 – Evoked potentials:

חושפים את הנבדק לגירויים מסוימים (למשל: גירוי וויזואלי) מס' פעמים, כדי לקבל תמונה ממוצעת, גל ממוצע, של הפעילות החשמלית במח בעקבות הגירוי. כך מקבלים אינדיקציה על מה קורה באזור מסוים של המח מבחינת פעילות חשמלית בעקבות גירוי מסוים. הרזולוציה היא של כמה עשרות מילי שניות (פוטנציאל פעולה בודד – 2 מילישניות) – כלומר אנו מסתכלים על תהליכים ארוכים יותר, תאים שמפעילים תאים אחרים, בסדר גודל של פ"פ.

שק' 36:

בעזרת אותן אלקטרודות, ובשימוש בזרם חשמלי בעוצמה מאד נמוכה, אפשר להפעיל את האזורים – לא רק לרשום את פעילותם.

אפשר לנסות לחקות את תבנית הגירוי של הפעולה הנורמלית – קשה מאד, בד"כ לא מצליחים. מה שיותר קל לעשות הוא לנטרל באופן שמני את האזור – כי הגריה שלא נורמלית משבשת את הפעילות.

טכניקה זו מיושמת כטכניקת ריפוי של פרקינסון, שמשבשת את הפעילות של אזורים מסוימים באופן שמוביל להקלה בסימפטומים של המחלה.

שק' 37 – TMS- transcarnial magnetic stimulation:

שיטה נוספת לגריה חיצונית של המח, במקרה זה לא משתמשים באלקטרודה חשמלית, אלא יוצרים סביב האזור שדה מגנטי מקומי, ויש תרגום של השדה המגנטי לגרייה חשמלית, מה שמאפשר לגרות את האזורים שתחת המכשיר.

לאחרונה משתמשים בטכניקה הזאת בבני אדם, יכולת השליטה המרחבית לא כל כך טובה, אך זה מאפשר להפעיל אזורים.

גם במקרה זה, רב בפעילות אינה חיקוי של פעילות האזור, אלא שיבוש שלה.

יישום – כטכניקה לטיפול בסוגים מסוימים של דיכאון. לא ברור איך בדיוק זה עוזר.

Optogenetics:

שיטה נוספת (לא נמצאת בספר!) גורמת לשינויים על ידי הנדסה גנטית של חיות המחקר, שבה מחדירים לתוך התאים גנים של מולוקולות שמושפעות על ידי אור, יש כמה אפשרויות:

1. גנים לייצור גנים פלורוסצנטיים. החיה המהונדסת תבטא את החלבון בתאים מסוימים, כך שאפשר לראות אותם בחתך של המח. אלו חומרים שייפלטו אור בתנאים מסוימים – כך שהתאים יזהרו באור פלורוסנטי כאשר מופעלים בהם פוטנציאלי פעולה.
2. אפשר לקחת מולוקולות של חלבונים שמושפעים מאור – יש סוג של אצות שעל הממברנה שלהן יש חלבון שהוא תעלה שנפתחת כאשר היא פוגשת אור. זה מכוון את האצות לכיוון של אור. החוקר לקח את הגן והכניס אותו לנוירונים בשיטות של הנדסה גנטית, כך שבחשיפה לאור נתרן וסידן נכנסים לתא וגורמים לו לדפולריזציה.

יותר מכך – את הבקרה הגנטית ניתן לכוון כך שהוא יתבטא רק בתאים מסויימים (למשל: תאים דופמינרגיים). זוהי דרך מאד אלגנטית להפעיל באופן ספציפי אוכלוסיות של תאים. הרעיון: להצליח להפעיל תאים ספציפיים באופן לא פולשני.עשו על כך ניסוי בזבובים, עם תעלה מושפעת מאור בתאים הדופמינגיים, חשפו אותם לאור, מבחוץ, ופתאום הזבובים (שבאופן נורמלי לא היו זזים) והם התחילו "להסתובב כמו משוגעים".

שק' 38- טכניקות נויורואנטומיות:

רקמה של מוח ללא צבע היא כמעט שקופה. צריכים לסמן את התאים כדי לראות את הגבולות בינהם. את הפרוסה של המח בשקופית שמו בתמיסה שצובעת את גרעיני התאים. כך אפשר לראות איפה נמצאים גרעיני התאים ואיפה החותר הלבן, וכן מהי צפיפות התאים.

שק' 39:

כדי להסתכל באופן יותר ספציפי על האינטראקציה בין מיקום התאים והחומרים אותם הם מייצרים משתמשים בשיטות אימונו(מערכת החיסון)-היסטוכימיות.

מערכת החיסון מזהה חלבונים זרים לגוף – בעיקר חיידקים או וויורוסים. איך? לחלבונים הזרים קוראים אנטיגנים, ומערכת החיסון מייצרת נוגדנים שלהם התאמה ספציפת לאנטיגנים, וכך היא מזהה אותם.על הבסיס הזה המציאו שיטות שמאפרות לסמן חלבונים ספציפיים על ידי נוגדנים. היתרון בשימוש בנוגדנים הוא בספציפיות המוחלטת שלהם.

פעמים רבות נשתמש בנוגדן אחד שמתחבר למולוקולה, ואח"כ משתמשים בנוגדנים לנוגדן, שאותם צובעים בצורה כלשהיא, (למשל: נוגדן פלורוסצנטי, אנזים שמכוון ריאקציה של חומר צבע במקום הספציפי בו הוא נמצא, סימון רדיואקטיבי), כך שאפשר לזהות באופן ספציפי נוכחות של חומר.

שק' 41:

TH טירוזין הידרוקסילאז נמצ רק בטרמינלים הסינפטיים.

בתמונה:

ירוק – טרמינליים

כחול – תאי המטרה עליהם הטרמינלים עושים סינפסות

שק' 42 - סימון רדיואקטיבי:

לוקחים פרוסת מח, טובלים בליגנד מסומן רדיואקטיבית, משהים כמה שעות, שוטפים וחושפים לסרט צילום.

שק' 43 – In-Situ Hybridization:

אפשר להסתכל אותם שיטות לא רק על חלבונים אלא גם על ביטוי ספציפי של גנים- על רמת הגן. למשל: אפשר לקחת רצף ספציפי של RNA שמשלים לרצף של חלבון מסוים, ולסמן אותו. חושפים את הרקמה לRNA מסומן ספיציפית, רדיואקטיבית. אח"כ שוטפים וחושפים לסרט צילום, ואז אפשר לראות איפה הגדילים הספציפיים האלה נמצאים.